pcr扩增试剂作用(pcr扩增试剂作用机理)

pcr扩增试剂作用机理

PCR全称多聚酶链式反应，原理是DNA的体外扩增。具体来说：在EP管里加入DNA、合成原料（dNTP、引物）、耐热的DNA聚合酶（taq）后，放入PCR仪，PCR仪会利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。用途：

1、核酸的基础研究：基因组克隆2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序3、反向PCR测定未知DNA区域4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控6、cDNA末端快速扩增技术7、检测基因的表达8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学

pcr扩增试剂盒使用说明

pcr结束后正确保持pcr产物分如下几种方法

1.pcr时往往不太可能即使取出pcr产物，因此，在pcr程序的最后通常会设定4～15℃ 永远这道程序，使pcr扩增完成后将产物保持在4～15℃。

2.获得pcr产物，凝胶电泳证明扩增正确后，一般用采用纯化试剂盒对pcr产物进行纯化，然后溶解在TE缓冲液，-20℃或-70℃冷冻保存；

3.如果需要长期保存，建议将纯化的pcr产物进行酒精沉淀，干燥冷冻保存可以保存非常久。

简述pcr扩增技术的原理及各试剂的作用

PCR基本原理:

PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物 延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

步骤：

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

模板DNA的变性

模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

模板DNA与引 物的退火(复性)

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

引物的延伸

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

拓展资料

聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction） (又称：多聚酶链式反应) PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

pcr扩增体系试剂组成包括哪些

1. 试剂准备阶段

试剂准备是 PCR 操作的第一个流程，需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存，除了 ddH 2 O 之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。

2. 样本制备阶段

样本制备是整个 PCR 反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。

所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换，要有「无核酸观念」 。

3. 核酸扩增

在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管，装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标，其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。

4. 产物分析

常见问题：

1）无 CT 值出现：模板量不足（杂质的引入及反复冻融的情况等）

2）CT 值出现过晚（大于 38）：各种反应成分的降解或加样量的不足

3）标准曲线线性相关性不佳：加样误差、标准品出现降解等

4）阴性对照有信号：模板有基因组的污染

5）扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制

6）扩增曲线的异常：模板的浓度太高或荧光染料的降解

四、实验室操作环境的维护

1） 各工作区要有一定的隔离，进入工作区域应按照单一的方向进行。试剂贮存和准备区 → 标本制备区 → PCR 扩增区 → 产物分析区单一方向进行。

2） 各个区域实验用品专用：各个区域实验设备和物品应有明确的标记，不能混用。

3） 实验场所要保持通风良好，严格监测各个工作区的温湿度。

4）注意实验室污染的预防。

整个 PCR 实验的操作都需要特别注意避免污染，来自样本的、试剂的以及实验室各种气溶胶，要始终保持「无核酸观念」。

pcr扩增试剂盒中成分有哪些

目前核酸检测试剂常见的国产种类有这几种:

一，杂交捕获免疫荧光法，保存温度：2-30℃；

二，乳胶法，保存温度：4-30℃；

三，酶联免疫法，保存温度：2-8℃；

四，胶体金法，保存温度：2-30℃；

五，荧光PCR法，保存温度：-205℃；

六，化学发光法，保存温度：2-8℃；

七，双扩增法，保存温度：A盒-40到-15℃，B盒2-8℃；

八，RNA捕获探针法，保存温度：A盒2-8℃，B盒低于-15℃；

九，荧光免疫层析法，保存温度：4-30℃；

十，磁微粒化学发光法，保存温度：2-8℃；

十一，稀土纳米荧光免疫层析法，保存温度：2-30℃；

十二，上转发光免疫层析法，保存温度：2-30℃。

pcr扩增仪的主要作用

看设备吧。我用的Applied Biosystem的thermal cycler是可以既做cDNA synthesis 又做qPCR反应的。但是之前用的Biorad的thermal cycler就只能做cDNA synthesis 和普通的PCR （不能定量）。

你主要要理解这两个反应的原理是什么，再看一下设备型号和说明书就知道了。

总的来说，这个所谓的扩增仪和合成仪本质上都只是一个控温加热器。所以在不要求定量的条件下，设定好加热控温程序，thermal cycler是都可以做的。但是做qPCR的仪器除了控温，还要有荧光检测（激光）装置，所以相应的仪器体积（包括激光扫描和防辐射外壳等）都比只能做普通PCR和cDNA合成的仪器要大很多。

希望回答了你的疑问。

pcr扩增试剂作用机理有哪些

PCR（聚合酶链式反应）技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性→退火→延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。